Kemangi (Ocimum basilicum L.) mengandung minyak atsiri yang dilaporkan memiliki aktivitas antibakteri. Berdasarkan sifat antibakterinya, maka minyak atsiri daun kemangi dapat dikembangkan menjadi mouthwash untuk mencegah timbulnya plak gigi. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian tween 80 (emulgator) dan gliserin (stabilizer) pada sifat fisik mouthwash, mengetahui perbandingan tween 80 dan gliserin yang menghasilkan mouthwash dengan stabilitas terbaik, serta melihat aktivitasnya sebagai agen antibakteri dan antibiofilm terhadap Streptococcus mutans secara in vitro. Minyak atsiri diperoleh dengan cara distilasi air dan uap air. Minyak atsiri kemudian diformulasi menjadi sediaan mouthwash dan dilakukan variasi jumlah tween 80 serta gliserin untuk mengetahui pengaruhnya terhadap sifat fisik sediaan. Aktivitas antibakteri dan antibiofilm diuji dengan metode mikrodilusi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa tween 80 berpengaruh signifikan terhadap kenaikan viskositas dan gliserin berpengaruh signifikan terhadap kenaikan massa jenis bila keduanya ditambahkan lebih dari 2,5 mL dalam 50 mL mouthwash. Dari lima formula yang dibuat, formula dengan perbandingan tween 80 dan gliserin = 3,75 mL : 1,25 mL ditemukan sebagai formula terbaik. Mouthwash daun kemangi menunjukkan aktivitas antibakteri dan antibiofilm terhadap Streptococcus mutans secara in vitro. Sediaan tersebut memiliki nilai KHM sebesar 0,1 % v/v dengan % penghambatan pertumbuhan bakteri sebesar 87,50 ± 3,33 %, sedangkan kadar optimum minyak atsiri daun kemangi yang mampu menghambat serta mendegradasi biofilm berturut-turut adalah 0,1 % v/v dan 0,2 % v/v dengan % penghambatan dan degradasi biofilm sebesar 77,52 ± 0,82 % dan 57,64 ± 6,09 %.