Latar belakang penelitian ini yaitu Lactobacillus plantarum merupakan bakteriasam laktat yang menghasilkan metabolit sekunder berupa bakteriosin yang bermanfaatdalam bidang kesehatan sebagai antimikroba dan produk pangan. Tujuan penelitian iniuntuk mengetahui waktu produksi optimum bakteriosin dari L.plantarum berdasarkankurva pertumbuhan dan aktivitas penghambatannya terhadap Staphylococcus aureus danEscherichia coli. Metode yang digunakan yaitu analisis kurva pertumbuhan berdasarkanhubungan besarnya absorbansi dari sampel bakteriosin yang diukur denganspektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 777,5 nm serta waktu inkubasi darijam ke-0 hingga ke-48 dan difusi cakram berdasarkan besarnya zona bening yangterbentuk di sekitar kertas cakram yang berisi bakteriosin dari L.plantarum pada fase loghingga stationer terhadap bakteri patogen S.aureus dan E.coli. Hasil penelitianmenunjukkan jam ke 32 merupakan waktu produksi optimum bakteriosin dariL.plantarum yaitu dihasilkan absorbansi terbesar sebesar 0,3215 dan terbentuk zonabening dengan diameter terbesar sebesar 11,28 mm terhadap S. aureus dan 8,37 mmterhadap E.coli. Hasil uji ANOVA diperoleh nilai signifikansi <0,05. Kesimpulan daripenelitian ini menunjukkan L.plantarum mengalami empat fase pertumbuhan selama 48jam, yaitu fase lag pada jam ke 0-4, fase log pada jam ke 4-30 , dan fase stasioner padajam ke 30-36 kemudian fase kematian dan bakteriosin memiliki aktivitas antibakteriterhadap S.aureus dan E.coli dari jam ke 24 hingga ke 36 serta aktivitas optimum padajam ke 28.Kata kunci: Bakteriosin, Escherichia coli, Lactobacillus plantarum, SpektrofotometerUV-Vis, Staphylococcus aureus.