Pegagan merupakan salah satu tanaman obat yang sudah mulai dibudidayakan secara intensif oleh masyarakat Indonesia. Budidaya pegagan perlu dilakukan dengan menerapkan Good Agricultural Practice untuk menghasilkan bahan baku terstandar termasuk penggunaan pupuk. Pupuk hayati telah banyak dikembangkan untuk mengurangi efek buruk penggunaan pupuk buatan terhadap lingkungan, sehingga budidaya tanaman secara organik menjadi salah satu alternatif. Penelitian ini bertujuan, mendapatkan pupuk organik terbaik untuk pertumbuhan, hasil dan mutu pegagan. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL), 3 ulangan dengan 8 perlakuan media tanam yang terdiri dari: (a) Tanah + pupuk organik + dolomit; (b) Tanah + pupuk organik + pupuk hayati 1 g; (c) Tanah + dolomit + pupuk hayati 1 g; (d) Tanah + pupuk organik + pupuk hayati 3 g; (e) Tanah + dolomit + pupuk hayati 3 g; (f) Tanah + pupuk organik + pupuk hayati 5 g; (g) Tanah + dolomit + pupuk hayati 5 g; dan (h) Tanah + pupuk hayati 3 g. Parameter pengamatan meliputi luas daun, panjang tangkai, jumlah daun, jumlah anakan, berat brangkasan basah, berat brangkasan kering dan kandungan asiatikosid. Hasil penelitian menunjukkan bahwa perlakuan media tanah + pupuk organik (1,5 kg) + dolomit (30 g) memberikan pengaruh yang lebih baik untuk pertumbuhan, produksi herba dan produksi asiatikosid pada pegagan. Perlakuan pupuk hayati (1 g) dengan kombinasi dolomit (30 g) memberikan pengaruh lebih baik dalam peningkatan jumlah anakan dan jumlah daun, sedangkan kombinasi pupuk hayati (5 g) dan dolomit (30 g) terbaik dalam kadar asiatikosid pada pegagan.