Tumbuhan Bayam duri (Amarhantus spinosus L.) secara empiris digunakan untuk mengobati berbagai penyakit diantaranya eksim, disentri dan diare. Aktivitas antibakteri dari daun bayam duri ini masih belum banyak diteliti. Tujuan penelitian ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas antibakteri serta menentukan nilai Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum (KHTM) dari ekstrak etanol bayam duri (Amarhantus spinosus L.) terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa. Penelitian ini meliputi ekstraksi daun bayam duri, penapisan fitokimia, kromatografi lapis tipis terhadap ekstrak bayam duri, uji aktivitas antibakteri, penentuan Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum (KHTM) dengan metode difusi agar dan uji banding dengan ekstrak daun sukun (Artocarpus communis Forst.). Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun Bayam Duri (Amaranthus spinosus) memiliki aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus , sedangkan pada Pseudomonas aeruginosa tidak memiliki aktivitas. Kosentrasi Hambat Tumbuh Minimum (KHTM) ekstrak etanol daun Bayam Duri (Amaranthus spinosus L.)terhadap Staphylococcus aureus berada pada rentang 6000 – 7000 ppm. Hasil uji banding daun bayam duri (Amarhantus spinosus L.) dengan ekstrak daun sukun (Artocarpus communis Forst.) terhadap Staphylococcus aureus sebesar 1 : 54,075