Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari kemampuan antimikroba bubuk biji kepayang sebagai pengawet alami cuko pempek untuk meningkatkan umur simpan hingga 12 hari penyimpanan. Metode yang digunakan yaitu RAK non faktorial dengan enam taraf perlakuan yaitu penambahan bubuk biji kepayang 0% (B0), 1% (B1), 2% (B2), 3% (B3), 4% (B4), dan 5% (B5) dengan 3 replikasi. Parameter yang diamati yaitu total asam, pH, Total Plate Count (TPC), uji organoleptik aroma dan rasa. Total asam cuko pempek tertinggi sebelum penyimpanan adalah B5 yaitu 0,604%, diikuti oleh B4, B3, B2 B1 dan B0 secara berurutan yaitu 0,602 %, 0,600 %, 0,599%, 0,598 % dan 0,596 %. Setelah 12 hari penyimpanan, total asam tertinggi terdapat pada B0 yaitu 1,427 sedangkan total asam terendah pada B3 yaitu 0,805 %. Sebelum penyimpanan, nilai pH terendah terdapat pada B5 yaitu 4,80 dan pH tertinggi terdapat pada B0 yaitu 4,92. Setelah 12 hari penyimpanan, pH terendah terdapat pada B0 yaitu 3,10 dan tertinggi pada B3 yaitu 4,63. TPC tertinggi terdapat pada B0 yaitu 2,6 x 102 CFU/mL setelah 12 hari penyimpanan sedangkan TPC terendah terdapat pada B3 yaitu 9,0 x 10 CFU/mL. Setelah 12 hari penyimpanan aroma dan rasa cuko perlakuan B3 paling disukai oleh panelis dengan skor 4,05 dan 4,25. Aroma dan rasa paling tidak disukai panelis terdapat pada B0 dengan skor yang sama yaitu 2,45. Penambahan bubuk biji kepayang 3% (B3) pada cuko pempek efektif menghambat pertumbuhan mikroba kontaminan selama 12 hari penyimpanan dan paling disukai oleh panelis dari segi aroma dan rasa.