Escherichia coli merupakan salah satu agen infeksius penyebab penyakit yang menyebabkan infeksi primer pada usus misalnya diare, infeksi saluran kemih, uretritis, pyelonefritis, pneumonia (karena aspirasi), meningitis pada bayi baru lahir dan septikemia. Resistensi antibiotik yang terjadi semakin mempersulit proses terapi penyembuhan pada penderita penyakit infeksi sehingga pemanfaatan bahan alam sebagai obat tradisional dapat menjadi alternatif selain penggunaan antibiotik. Salah satu contoh tanaman yang sering digunakan menjadi obat-obatan tradisional adalah daun pepaya. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui aktivitas antibakteri ekstrak daun pepaya (Carica papaya L) terhadap pertumbuhan bakteri Escherichia coli dan seberapa kuat potensi ekstrak daun pepaya sebagai antibakteri terhadap pertumbuhan bakteri Escherichia coli berdasarkan diameter zona hambat yang terbentuk. Metode jenis penelitian ini adalah eksperimental laboratoris in vitro menggunakan the post test only control group design. Metode pengujian antibakteri yang digunakan adalah metode difusi agar menggunakan cakram disk. Penelitian ini menggunakan 10 kelompok perlakuan yang terdiri dari antibiotik ciprofloxacin sebagai kontrol positif, aquades steril sebagai kontrol negatif, dan ekstrak etanol daun pepaya 100%, 75%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,12%, 1,56%, dengan tiga kali pengulangan. Ekstraksi dilakukan dengan cara maserasi menggunakan pelarut etanol 70%. Hal yang diamati dari penelitian ini ada diameter zona hambat yang terbentuk di sekeliling disk setelah inkubasi 24 jam. Hasil Uji Kruskal-Wallis menunjukkan p = 0,001 yang berarti terdapat perbedaan besar zona hambat antara dua kelompok (p < 0,05). Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun pepaya terlihat pada semua konsentrasi mulai dari 100% hingga 1,56%. Konsentrasi 100%, 75%, dan 50% mempunyai potensi antimikroba yang kuat sedangkan konsentrasi 25%, 12,5%, 6,25%, 3,12%, 1,56% mempunyai potensi sedang.