Mikroalga mengandung metabolit sekunder yang potensial untuk dikembangkan. Metabolit sekunder digunakan untuk pertahanan kimia terhadap predator di lingkungan air. Salah satu jenis mikroalga yang dapat dikembangkan metabolit sekundernya adalah Chlorella sp. Kondisi lingkungan saat kultivasi Chlorella sp. mempengaruhi jumlah sel, kandungan metabolit sekunder dan kestabilan senyawa antioksidan mikroalga. Faktor lingkungan yang menjadi fokus penelitian adalah faktor cahaya. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis kandungan fitokimia dan antioksidan biomassa mikroalga Chlorella sp. dengan variasi waktu pencahayaan. Variasi pemberian cahaya pada proses kultivasi menggunakan periode terang : gelap yang terbagi menjadi 2 kelompok yaitu 12:12 (terang:gelap) jam dan 18:6 (terang:gelap) jam. Metode yang digunakan untuk analisis kandungan fitokimia menggunakan metode Harborne dan analisis aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl). Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak mikroalga Chlorella sp. dengan variasi waktu pencahayaan (terang:gelap) 12:12 jam mengandung alkaloid, flavonoid, saponin, steroid, kuinon dan terpenoid. Sedangkan, ekstrak mikroalga Chlorella sp. dengan variasi waktu pencahayaan (terang:gelap) 18:6 jam mengandung alkaloid, flavonoid, saponin dan terpenoid. Hasil aktivitas antioksidan ekstrak mikroalga Chlorella sp. dengan variasi waktu pencahayaan (terang:gelap) 12:12 jam IC50 sebesar 40,421 dan ekstrak Chlorella sp. dengan variasi waktu pencahayaan (terang:gelap) 18:6 jam memiliki IC50 sebesar 8,992. Berdasarkan penelitian diperoleh bahwa ekstrak mikroalga yang diberi waktu pencahayaan tinggi menghasilkan aktivitas antioksidan yang lebih kuat dibandingkan pencahayaan rendah.