Biskuit merupakan salah salah satu jenis kue kering yang memiliki citarasa manis, berbentuk kecil dan dibuat dengan cara pemanggangan dan berbahan dasar tepung terigu, kuning telur, margarin dan gula halus. Dengan menggunakan tepung talas dan tepung tapioka dapat menghasilkan produk biskuit yang bebas gluten. Penelitian ini bertujuan untuk memahami pengaruh substitusi tepung tapioka dan tepung talas terhadap karakteristik kimia dan organoleptik biskuit bebas gluten. Rancangan penelitian Rancangan Acak Lengkap (RAL) satu faktor dengan 4 perlakuan perbandingan tepung talas dan tepung tapioka yaitu P0 (100:0) , P1 (75:25), P2 (50:50) dan P3 (25:75). Data diolah menggunakan ANOVA. Hasil analisis sidik ragam menunjukkan pengaruh nyata pada taraf p0,05 dan pengujian dilakukan dengan menggunakan Duncan Multiple Range Test (DMRT). Hasil penelitian menunjukkan nilai kadar air biskuit bebas gluten berkisar antara 1.49%-2.16%, kadar protein berkisar 2.45%-10.95%, lemak berkisar 9.98%-11.19%, karbohidrat berkisar 75.33%-82.52% dan serat 1.87%-3.41%. Berdasarkan hasil penelitian ini menunjukkan bahwa perlakuan memberikan pengaruh nyata terhadap protein, lemak, karbohidrat, serat dan pada kadar air dan kadar abu tidak memberikan pengaruh nyata. Sedangkan pada pengujian organoleptik meliputi warna dengan skor 4,6 – 5,4 (agak suka sampai suka), rasa dengan skor 5,1 – 5,6 (suka), aroma dengan skor 5,0 – 5,3 (suka) dan tekstur dengan skor 4,9 – 5,6 (agak suka sampai suka). Perlakuan terbaik dari penelitian ini yaitu pada P1 dengan perbandingan tepung talas 75 gr dan tepung tapioka 25 gr.