Resistensi terhadap antibiotik telah menjadi isu penting dalam bidang kesehatan khususnya farmasi. Telah ditemukan beberapa jenis bakteri yang memiliki kemampuan resisten terhadap antibiotik yaitu Escherichia coli dan Bacillus substillus. Tujuan penelitian ini yaitu untuk mengetahui sensitivitas antibiotik terhadap Escherichia coli dan Bacillus substillus terhadap antibiotik kloramfenikol dan polymixin. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental yang dilaksanakan di Laboratorium Biologi Universitas PGRI Argopuro Jember. Pengujian sensitivitas menggunan metode difusi dan dilusi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada dosis 31,25 ppm antibiotik kloramfenikol (3,29 cm) dan polymixin (2,48) dapat menghambat pertumbuhan bakteri Eschericia coli dan Bacillus substillus yang paling tinggi. Kesimpulan penelitian ini yaitu kedua senyawa uji memiliki kemampuan dalam melawan kedua jenis bakteri uji. Sehingga dapat dikatakan bila kedua senyawa uji memiliki spectrum yang luas.