Latar Belakang : Kepatuhan mencuci tangan merupakan program yang dilakukan oleh WHO untuk mengatasi Healthcare Associated Infections / HAIs. Pelaksanaan program ini dipengaruhi oleh berbagai hal seperti pengetahuan dan motivasi dari perawat. Pada Rumah Sakit Pluit kepatuhan mencuci tangan perawat sudah sebagian tercapai tetapi masih ada penurunan pada bulan Februari 83 %, Mei 80 %, Juni 80 %, November 82% pada penurunan bulan ini salah satu upaya yang ingin dilakukan adalah kesadaran perawat terhadap kepatuhan mencuci tangan. Tujuan : Untuk mengetahui Hubungan pengetahuan dan motivasi perawat dengan kepatuhan mencuci tangan di Rumah Sakit Pluit. Metodologi: Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah penelitian kuantitatif dengan menggunakan desain deskriptif analitik dengan pendekatan cross-sectional menggunakan kuesioner dengan uji chi-square. Hasil Penelitian : Hasil uji chi-square didapatkan hubungan antara pengetahuan dengan p-value 0,000 dan motivasi p-value 0,000 dengan Odds ratio 53,750 pengetahuan dan motivasi 23,917. Simpulan: Ada hubungan pengetahuan yang baik dan motivasi yang tinggi terhadap kepatuhan mencuci tangan. Saran: Diharapkan dapat menjadi bahan evaluasi dengan mengedukasi / memberikan pelatihan secara rutin untuk meningkatkan pengetahuan dan motivasi perawat dengan kepatuhan mencuci tangan agar bisa meningkatkan kualitas pelayanan rumah sakit. Kata Kunci: Pengetahuan, Motivasi, Kepatuhan Mencuci Tangan. Kepustakaan : 40 pustaka (2009 -2022)