ABSTRAK: Isolasi minyak atsiri dari rimpang jeringau (Acorus calamus Linn) dan uji aktivitas antibakteri terhadap bakteri Escherichia coli (E. coli) dan Staphylococcus aureus (S. aureus) telah dilakukan. Ekstraksi minyak atsiri dilakukan dengan metode destilasi uap, uji aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode sumur difusi, dan identifikasi senyawa dilakukan dengan kromatografi gas-spektroskopi massa (KG-SM). Rendemen minyak yang dihasilkan sebesar 0,1653% (b/b) dengan berat jenis 1,066 g/mL. Minyak atsiri dengan konsentrasi 10% (v/v) menunjukkan aktivitas penghambatan yang kuat terhadap pertumbuhan E. coli dan S. aureus dengan diameter hambat masing-masing sebesar 11,33 mm dan 13,57 mm. Nilai konsentrasi hambat minimum (KHM) minyak atsiri terhadap E. coli dan S. aureus masing-masing sebesar 4 dan 0,4% dengan zona hambat berturut-turut 6,67 dan 8,83 mm. Kandungan senyawa utama dalam minyak atsiri rimpang jeringau adalah euasaron dan asaron yang telah diketahui memliki aktivitas sebagai antibakteri. Kata kunci: Minyak atsiri, Acorus calamus Linn, Antibakteri, Escherichia coli, Staphylococcus aureus ABSTRACT: Isolation of essential oils from rhizome of Jeringau (Acorus calamus Linn) and the antibacterial activity assay against Escherichia coli (E. coli) and Staphylococcus aureus (S. aureus) has been performed. Essential oil extraction was done by steam distillation method, antibacterial activity test was conducted by diffusion wells, and compound identification was conducted by gas chromatography-mass spectroscopy (GC-MS). The essential oils with a concentration of 10% (v/v) showed a strong inhibitory activity against the growth of E. coli and S. aureus with diameter inhibition of 11.33 mm and 13.57 mm respectively. Minimum inhibitory concentration (MIC) of the oils against E. coli and S. aureus was 4 and 0.4% respectively with the inhibition zone of 6.67 and 8.83 mm. The main compounds of the oils were euasaron and asaron known having antibacterial activity.