Jumlah kasus DBD pada tahun 2016 meningkat tajam bila dibandingkan tahun 2015 di Kabupaten Banyumas. Penggunaan insektisida telah dilakukan untuk pengendalian vektor Demam Berdarah dalam waktu yang lama. Insektisida Golongan Organofosfat jenis malathion telah digunakan sejak tahun 1991 dan sudah tidak digunakan lagi sejak tahun 2013 di Kabupaten Banyumas. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui status resistensi terhadap insektisida golongan organofosfat pada populasi nyamuk Aedes Sp di Kabupaten Banyumas dengan uji biokimia. Jenis penelitian ini eksploratif. Metode penelitian menggunakan uji biokimia (uji mikroplat/ uji enzimatis). Peningkatan aktivitas enzim esterase dibaca dengan menggunakan ELISA reader dengan panjang gelombang 450 nm. Hasil penelitian secara keseluruhan menunjukkan bahwa di Desa Kedungrandu nyamuk resisten 8,33%, nyamuk toleran 66,67% dan rentan 25% sedangkan di Desa Sidamulih nyamuk toleran masih 90,9% dan nyamuk rentan 9,1%. Hasil uji statistik independent T-Test dengan nilai siginifilkansi =0,565, menunjukkan bahwa pemeriksaan kandungan enzim esterase di dalam tubuh nyamuk diantara kedua desa tersebut dinyatakan tidak ada perbedaan, artinya paparan insektisida organofosfat yang diterima oleh nyamuk Aedes Sp dikedua desa tersebut relatif sama.Kesimpulan penelitian yaitu status resistensi nyamuk Aedes Sp terhadap insektisida golongan organofosfat di Desa Kedungrandu 8,33% nyamuk dinyatakan resisten sedangkan yang toleran Desa Sidamulih 1,36% lebih tinggi dibandingkan Desa Kedungrandu. Disarankan kepada pemerintah Dinas Kesehatan Kabupaten Banyumas hendaknya pergantian insektisida menggunakan insektisida yang belum pernah digunakan dalam program pengendalian vektor penyakit DBD di Indonesia demi efektivitas dan keberhasilan program itu sendiri serta mengutamakan upaya pemberantasan sarang nyamuk di masyarakat.