The alteration of environmental characteristics and population separation caused by long term river barrage may affect morphological and genetic variation. This research aimed to ensure that the barb of this research is Barbonymous balleroides and to analyze genetic variation of barb at various habitats (upstream, reservoir, and downstream zones) in Serayu River, Banjarnegara. This research was conducted through DNA isolation and amplification by PCR and sequencing, along with water quality measurement. Result of phylogenetic tree showed that Barbonymus balleroides separated from its’ outgroup (Puntius orphoides dan Barbonymus gonionotus) as 6.34%. Genetic intraspecies distance of B. balleroides showed two clusters by similarity 2.0%. Barb population in Serayu River was identified as B. balleroides based on 710 bp fragment length of CO1 gene. Mrica reservoir development caused habitat fragmentation in Serayu River and increased genetic variation of barb population. Barb of downstream zone formed separate cluster from barb of reservoir and upstream zones marked basa cytosine (C) to downstream zone compared reservoir and upstream zone. Abstrak Perubahan karakteristik lingkungan dan pemisahan populasi ikan akibat pembendungan sungai dalam jangka waktu yang lama dapat menyebabkan variasi morfologi (morfometrik) dan genetik. Penelitian ini bertujuan untuk memastikan bahwa ikan brek yang dikaji pada penelitian ini adalah spesies Barbonymus balleroides dan mengkaji variasi ge-netik ikan brek pada berbagai habitat (hilir, waduk dan hulu) di Sungai Serayu wilayah Kabupaten Banjarnegara. Pe-nelitian meliputi isolasi dan amplifikasi DNA dengan PCR dan sekuensing, serta pengukuran parameter lingkungan. Hasil penelitian dari pohon filogenetik menunjukkan bahwa spesies ikan brek (Barbonymus balleroides) dan out gro-upnya (Puntius orphoides dan Barbonymus gonionotus) berbeda dengan jarak genetik ‘P’ sebesar 6,34%. Jarak genetik intraspesies B. balleroides memperlihatkan terdapat dua klaster dengan jarak perbedaan 2,0%. Populasi ikan brek yang dianalisis termasuk ke dalam spesies B. balleroides berdasarkan panjang fragmen 710 bp gen CO1. Pembangunan Wa-duk Mrica menyebabkan terjadinya fragmentasi habitat di Sungai Serayu. Hal ini mengakibatkan variasi genetik pada ikan brek. Ikan brek yang mendiami zona bawah waduk membentuk klaster yang terpisah dari ikan brek yang mendiami zona waduk dan atas waduk ditandai adanya basa sitosin (C) pada zona bawah dibandingkan zona lainnya.