Spektrofotometri derivatif ultraviolet (SDUV) telah digunakan dalam menentukan kadar flavonoid obat herbal tanpa adanya proses pemisahan dan pemakaian pereaksi kromogenik. Metode SDUV yang digunakan didasarkan pada pengukuran jarak puncak dari garis nol (Dz) pada panjang gelombang 276 nm pada spektrum derivat ketiga larutan contoh. Hasil evaluasi kinerja analitik dari metode SDUV yang dikembangkan diperoleh linearitas untuk kurva kalibrasi ditunjukkan dengan nilai koefisien korelasi sebesar 0.9984 pada kisaran konsentrasi flavonoid total yang diekspresikan sebagai ekivalen kuersetin 5-20 g/mL. Presisi dari metode SDUV menunjukkan hasil yang cukup baik yang ditunjukkan dengan nilai persen simpangan baku relatif sebesar 4,48 dan akurasi yang dievaluasi dengan membandingkan kadar yang diperoleh dari metode SDUV dan pembanding (AlCl3) menunjukkan nilai yang tidak berbeda nyata. Estimasi limit deteksi dan kuantifikasi dari metode SDUV diperoleh sebesar 0,67 g/mL dan 2,24 g/mL. Dari hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa metode SDUV dapat digunakan untuk penentuan kadar flavonoid total obat herbal Biouric untuk tujuan kendali mutunya. Kata Kunci: flavonoid total, obat herbal, spektrofotometri derivatif ultraviolet