Jamur entomopatogen merupakan jenis bioinsektisida yang dapat digunakan untuk mengendalikan hama pada tanaman. Pengendalian menggunakan bioinsektisida yang berbahan aktif jamur entomopatogen merupakan salah satu cara pengendalian yang ramah lingkungan serta tidak berdampak negatif bagi lingkungan dan tidak merusak ekosistem disekitarnya. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi jamur entomopatogen yang terdapat pada lahan tanaman pangan, hortikultura, dan perkebunan dan mengetahui tingkat patogenisitas jamur tersebut sebagai entomopatogen pada Spodoptera litura. Lokasi pengambilan sampel berada di Saloloang, Kabupaten Penajam Paser Utara, Kalimantan Timur. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Hama Penyakit Tanaman Fakultas Pertanian, Universitas Mulawarman, pada bulan Agustus 2020 hingga Maret 2021. Perlakuan menggunakan isolat jamur entomopatogen yang berhasil di isolasi dengan insect bait method menggunakan larva Tenebrio molitor. Uji patogenisitas dirancang dalam Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 4 perlakuan dan 5 ulangan. Data dianalisis menggunakan sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjut menggunakan uji beda nyata terkecil (BNT) pada taraf 5%. Hasil penelitian ini ditemukan 4 jenis jamur entomopatogen yang di isolasi di Kabupaten Penajam Paser Utara yaitu Aspergillus sp. isolat lahan tanaman perkebunan, Cunninghamella sp. isolat lahan tanaman hortikultura, Fusarium sp. isolat lahan tanaman pangan dan perkebunan, dan Metarhizium sp. isolat lahan tanaman pangan, hortikultura, dan perkebunan. Semua isolate jamur Metarhizium sp. efektif mengendalikan ulat grayak (Spodoptera litura) in vitro dengan kerapatan spora 105/mL.