Ketombe merupakan gangguan yang terjadi di kulit kepala di mana salah satu penyebabnya adalah jamur. Salah satu bahan alam yang diketahui dapat digunakan sebagai antiketombe adalah buah lemon. Kandungan yang terdapat di dalam minyak atsiri buah lemon seperti flavanoid, monoterpen, dan seskuiterpen diketahui memiliki aktivitas sebagai antijamur. Tujuan penelitian ini adalah untuk menguji aktivitas minyak atsiri buah lemon dalam bentuk sediaan gel sampo terhadap jamur Malassezia sp. Penelitian ini diawali dengan penetapan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dari minyak astsiri buah lemon secara mikrobiologi untuk mendapatkan konsentrasi bahan aktif dalam formulasi sediaan sampo gel. Orientasi formula meliputi variasi konsentrasi karbomer dan Hidroksi Propil Metil Selulosa (HPMC) sebagai basis gel. Evaluasi stabilitas sediaan gel meliputi pengamatan organoleptis, homogenitas, pH, dan viskositas. Dilakukan uji aktivitas antiketombe dari formula terbaik terhadap jamur Malassezia sp. Hasil menunjukkan bahwa Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) minyak atsiri terhadap jamur Malassezia sp. adalah 0,5%. Formula yang menunjukkan hasil terbaik setelah evaluasi sediaan adalah formula yang mengandung basis HPMC sebanyak 6%. Sediaan sampo gel terbaik memiliki aktivitas sebagai antiketombe dengan memberika diameter hambat sebesar 29,4 mm terhadap jamur Malassezia sp. Kata kunci: Minyak atsiri, buah lemon, antiketombe, gel sampo, Malassezia sp.