Computer Vision Syndrome (CVS) didefinisikan sebagai sekumpulan masalah mata dan penglihatan yang berhubungan dengan aktivitas penggunaan komputer. Ditandai adanya gejala visual sebagai hasil dari interaksi dengan tampilan komputer. Gejala okuler utama yang dilaporkan adalah mata tegang, iritasi, sensasi terbakar, mata merah, pandangan buram, penglihatan ganda. Prevalensi kejadian CVS pada mahasiswa teknik dan kedokteran cukup tinggi. Teori sebelumnya menyebutkan bahwa pengetahuan menjadi faktor predisposisi yang mempengaruhi kesehatan seseorang. Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan hubungan tingkat pengetahuan dengan kejadian CVS pada Mahasiswa Program Studi Informatika Universitas Muhammadiyah Semarang. Metode penelitian adalah observasional analitik dengan desain penelitian cross-sectional. Penelitian dilakukan di Program Studi S1 Informatika Universitas Muhammadiyah Semarang pada bulan Maret 2022. Sampel dipilih menggunakan teknik consecutive sampling. Instrumen yang digunakan adalah kuesioner tingkat pengetahuan dari penelitian sebelumnya yang telah dimodifikasi dan Computer Vision Syndrome Questionnaire (CVS-Q). Analisis bivariat menggunakan uji Chi Square. Jumlah responden yang sesuai kriteria ekslusi dan inklusi sebanyak 73 orang. Mayoritas responden memiliki tingkat pengetahuan kurang (57,5%), diikuti pengetahuan cukup (21,9%) dan terendah dengan tingkat pengetahuan baik sebanyak (20,5%). Sebanyak (63%) mengalami CVS dan sisanya yaitu (37 %) tidak mengalami CVS. Terdapat hubungan antara tingkat pengetahuan dengan kejadian Computer Vision Syndrome p = 0,000 (p < 0,05).