Eksplorasi mikroorganisme baru merupakan suatu hal yang penting, karena mikroorganisme mempunyai potensi yang sangat luas sebagai sumber biomolekul baru seperti enzim, antimikroba, antikanker, agen bioremediasi, dan penghasil bahan bakar hayati. Hingga saat ini, kurang dari 1% bakteri di alam yang berhasil dikultivasi. Kebutuhan industri terhadap biomolekul yang tahan terhadap kondisi ekstrem sangatlah tinggi. Salah satu sumber biomolekul yang potensial adalah bakteri termofilik. Indonesia kaya akan habitat termofilik, khususnya sumber air panas, namun eksplorasinya masih sangat terbatas. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan isolat tunggal bakteri termofilik dari sumber air panas Gedong Songo dengan media minimal YT (Yeast Tripton) dalam kondisi anaerob serta melakukan identifikasi bakteri termofilik tersebut secara genotipik dan fenotipik. Pada penelitian ini dilakukan isolasi bakteri termofilik sumber air panas Gedongsongo dengan media pengaya minimal YT pada kondisi anaerob serta identifikasi bakteri secara genotipik dan fenotipik. Identifikasi genotipik dilakukan dengan menggunakan analisis urutan nukleotida gen 16S rRNA. Identifikasi fenotipik dilakukan melalui uji morfologi meliputi uji pewarnaan gram dan uji mikroskop. Selain itu dilakukan uji potensi enzim ekstraseluler termostabil, meliputi amilase, protease, β-galaktosidase, dan selulase. Hasil penelitian diperoleh isolat tunggal bakteri termofilik anaerob yang diberi nama isolat GS Ytan, dengan karakteristik bentuk batang, gram positif, dan memiliki kemiripan dengan bakteri kelompok Anoxybacillus sp. dengan tingkat kekerabatan sebesar 97-99 %. Isolat GS YTan memiliki hubungan terdekat dengan Anoxybacillus sp. AF/04 dan Anoxybacillus sp. HT14. Isolat GS YTan memiliki potensi enzim ekstraseluler termostabil amilase, protease dan β-galaktosidase.