Bakteri termofilik merupakan bakteri yang mampu bertahan hidup pada suhu tinggi di mana salah satu habitatnya adalah sumber air panas. Indonesia memiliki banyak sumber air panas yang potensial sebagai habitat bakteri termofilik. Dalam penelitian ini dilakukan isolasi bakteri termofilik sumber air panas gedongsongo dengan menggunakan pendekatan minimal media MB (Minimal Broth) dan TS (Taoge Sukosa) serta identifikasi fenotip dengan uji mikrobiologi yang meliputi pewarnaan gram dan morfologi dan identifikasi genotip dengan menggunakan urutan nukleotida gen 16S rRNA dan konstruksi pohon filogenetik dengan menggunakan program Phylip 3.68 ed. metode Distance matrix (Neighbour joining). Identifikasi enzim ekstraseluler secara kualitatif dilakukan dengan menggunakan media selektif yang meliputi uji selulase, uji a-amilase, uji protease dan uji P-galaktosidase. Dari penelitian diperoleh dua isolat tunggal bakteri termofilik yaitu isolat GS_MBan dan isolat GS_TSan. Isolat GS_MBan memiliki kemiripan dengan bakteri kelompok Anoxybacillus sp. sebesar 94-99%, berbentuk batang, bakteri gram positif, memiliki enzim ekstraseluler a-amilase, protease dan P-galaktosidase serta tidak menunjukkan potensi adanya enzim ekstraseluler selulase. Isolat GS_TSan memiliki kemiripan dengan bakteri kelompok Thermoanaerobacterium sp. sebesar 78-86%, berbentuk batang, bakteri gram negatif, memiliki enzim ekstraseluler a-amilase dan protease serta tidak menunjukkan potensi adanya enzim ekstraseluler P-galaktosidase dan selulase.