Budidaya lele (Clarias sp.) cukup prospektif untuk terus dikembangkan, tetapi di lapangan sering mendapat kendala, salah satunya adalah penyakit bakterial. Infeksi bakteri patogen pada ikan dapat menyebabkan munculnya gejala klinis bahkan kematian. Oleh karena itu, perlu diketahui jenis bakteri penyebab lele sakit agar dapat dilakukan upaya pengendaliannya. Penelitian ini bertujuan untuk isolasi, karakterisasi dan identifikasi bakteri penyebab penyakit pada lele. Penelitian yang dilakukan merupakan penelitian deskriptif kualitatif dengan metode survei dan teknik pengambilan sampel menggunakan purposive random sampling. Pengambilan sampel ditentukan dari satu kolam budidaya lele di Desa Singasari dan Cikawung, Banyumas. Uji postulat Koch dilakukan untuk membuktikan isolat bakteri yang diisolasi merupakan bakteri penyebab penyakit pada lele. Isolat yang telah diuji postulat Koch kemudian diidentifikasi secara morfologi dan biokimiawi. Hasil isolasi bakteri diperoleh 17 isolat dari daerah Singasari dan Cikawung. Sebanyak tujuh isolat dari dua tempat tersebut dilakukan uji lanjut. Hasil uji postulat Koch menunjukkan bahwa mortalitas ikan selama 14 hari pengamatan mencapai 60-100%. Gejala klinis eksternal yang muncul, yaitu hiperemia, hemoragik, depigmentasi, white spot, ulser, erosi, sirip progresif, abdominal dropsi, dan exopthalmia color alteration. Gejala klinis internal yang muncul, yaitu hati pucat, ginjal kehitaman, usus kehitaman, empedu pecah, insang pucat, edema, dan asites. Hasil karakterisasi secara morfologi dan biokimiawi berdasarkan Bergeys’s Manual of Systematic Bacteriologi 2nd Edition diperoleh bahwa ketujuh isolat adalah bakteri Aeromonas sp., dengan kesamaan ciri, yaitu Gram negatif, fermentatif, katalase positif, oksidase positif, dan memproduksi gas.