Petani penyemprot merupakan salah satu populasi berisiko untuk mengalami keracunan pestisida akibat dari aktivitas pertanian yang sangat dekat dengan pestisida. Untuk mengetahui adanya paparan pestisida dan penilaian risiko keracunan pestisida adalah dengan pengukuran kadar serum cholinesterase. Tujuan penelitian ini adalah membuktikan hubungan antara pengetahuan, perilaku merokok ketika menyemprot, dan kelengkapan Alat Pelindung Diri (APD) ketika menyemprot dengan kadar serum cholinesterase pada petani penyemprot. Jenis penelitian ini observasional dengan desain studi cross sectional. Jumlah sampel 88 petani penyemprot di Desa Dukuhlo Kabupaten Brebes. Sampel diambil dengan teknik acak sederhana. Hasil analisis multivariat dengan multipel regresi logistik menunjukkan bahwa faktor yang terbukti berhubungan dengan kadar serum cholinesterase adalah pengetahuan tentang pestisida p=0,005 (OR=12,369; 95% CI=2,1-71,5) dan merokok ketika menyemprot p=0,005 (OR=9,641; 95% CI=2,0-46,1). Petani penyemprot yang memiliki pengetahuan kurang tentang pestisida mempunyai risiko 12,3 kali lebih besar dibandingkan dengan mereka yang memiliki pengetahuan tentang pestisida yang baik dan petani penyemprot yang merokok ketika menyemprot mempunyai risiko 9,6 kali lebih besar dibandingkan dengan mereka yang tidak merokok. Pengetahuan tentang pestisida dan merokok ketika menyemprot terbukti berhubungan dengan kadar serum cholinesterase pada petani penyemprot.