Keberhasilan transformasi genetika pada tanaman padi sangat dipengaruhi oleh karakternya yang bersifat recalsitrant, terutama padi jenis indica yang banyak ditanam oleh petani di Indonesia. Oleh karena itu, optimasi metode selalu diperlukan sebelum melakukan transformasi genetika pada tanaman padi. Transformasi gen GUS sering digunakan sebagai sarana optimasi metode transformasi sebelum melakukan overekspresi gen yang sesungguhnya. Penelitian ini bertujuan untuk memastikan bahwa komponen transformasi gen melalui Agrobacterium tumefaciens dapat bekerja secara efektif pada tanaman padi. Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biosain Politeknik Jember dari bulan Maret sampai dengan Desember 2013. Konstruk gen GUS diperoleh dari Laboratorium Biologi Molekuler Universitas Jember. Padi yang digunakan adalah varietas Inpari 20 dari BPTP Malang dan CV Dongjin dari Korea Selatan sebanyak 20 biji dari setiap verietas. Hasil penelitian menunjukkan bahwa transformasi gen GUS melalui Agrobacterium tumefaciens berhasil menginfeksi eksplan. Eksplan yang diinfeksi tumbuh pada media seleksi antibiotik higromisin sampai umur 65 hari setelah infeksi. Hasil uji GUS menunjukkan bahwa gen GUS tidak terekspresi pada tanaman Padi. Hal ini menunjukkan bahwa ada kemungkinan DNA promoter dan plasmit pCAMBIA tidak kompatibel pada tanaman padi. Agrobacterium tumefaciens dapat digunakan untuk transformasi genetika pada tanaman padi, tetapi perlu DNA promoter dan plasmit yang kompatibel.Kata kunci: Optimasi, transformasi, gen GUS, Agrobacterium tumefaciens, dan padi.