Daun pegagan (Centella asiatica L.) mengandung bahan aktif seperti saponin, tanin, flavonoid, steroid serta triterpenoid yang dapat mereduksi ion perak. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah air rebusan daun pegagan dapat digunakan sebagai bioreduktor dalam mensintesis nanopartikel perak serta untuk mengetahui apakah hasil biosintesis daun pegagan memiliki aktivitas daya hambat terhadap bakteri Pseudomonas aeruginosa dan Staphylococcus aureus. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental. Penentuan aktivitas daya hambat terhadap bakteri Pseudomonas aeruginosa dan Staphylococcus aureus dengan metode difusi cakram. Hasil penelitian menunjukan air rebusan daun pegagan segar dapat digunakan sebagai bioreduktor dalam mensintesis nanopartikel perak yang ditandai dengan adanya puncak serapan pada panjang gelombang 400-500 nm. Ukuran nanopartikel perak yang dihasilkan berkisar 50 s/d 90 nm. Aktivitas antibakteri dari hasil biosintesis memiliki rata-rata zona hambat 25 mm (sangat kuat) untuk bakteri Pseudomonas aeruginosa dan 22,6 mm (sangat kuat) untuk Staphylococcus aureus. Disimpulkan bahwa daun pegagan dapat mereduksi dan memiliki aktivitas antibakteri terhadap Pseudomonas aeruginosa dan Staphylococcus aureus.