Penelitian ini dilakukan untuk menentukan jenis substrat, pH, suhu, dan lama fermentasi terbaik untuk menghasilkan N-asetilglukosamin oleh bakteri Providencia stuartii. Bakteri Providencia stuartii yang digunakan merupakan hasil isolasi dari penelitian sebelumnya. Kondisi fermentasi terbaik ditentukan dengan melakukan fermentasi pada berbagai suhu (32oC, 37oC, dan 42oC), pH (5, 6, 7, dan 8), serta lama fermentasi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa konsentrasi N-asetilglukosamin tertinggi dengan menggunakan substrat tepung cangkang udang dihasilkan pada suhu fermentasi 37oC dengan pH media 7 dan lama fermentasi 9 hari, yaitu sebesar 178.752,670 ± 1.774,478 ppm. Sedangkan konsentrasi N-asetilglukosamin tertinggi dengan menggunakan substrat kitin dihasilkan pada suhu fermentasi 37oC dengan pH media 8 dan lama fermentasi 4 hari, yaitu sebesar 68.789,00 ± 2682,65 ppm.