Herba Tespong (Oenanthe javanica (Blume) DC), merupakan salah satu tanaman tradisonal yang telah lama digunakan sebagai obat untuk meringankan berbagai penyakit. Berbagai aktivitas biologis telah diujikan salah satunya adalah antikanker. Pada penelitian sebelumnya diketahui bahwa Oenanthe javanica mengandung alkaloid, flavonoid dan saponin, dan fenol. Pada penelitian lain, ekstrak etanol herba tespong dilaporkan memiliki aktivitas sitotoksik dengan nilai LC50 sebesar 91,20 ppm. Dalam penelusuran literatur, belum ditemukan penelitian mengenai uji sitotoksik dan antiproliferasi isolat herba tespong serta identifikasi dari isolate aktifnya. Oleh karena itu, peneltian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas sitotoksik dan antiproliferasi dari isolat herba tespong terhadap sel kanker payudara MCF7 dan mengidentifikasi senyawa aktif yang terkandung dalam isolat herba tespong. Metode isolasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah kromatografi radial atau kromatotron. Metode MTT digunakan untuk uji aktivitas sitotoksik dengan menggunakan konsentrasi 50; 40; 30; 20 dan 10 µg /mL dan kontrol positif doksorubicin dengan konsentrasi 25; 12,5; 6,25; 3,125 dan 1,625 µg /mL. Metode doubling time dilakukan untuk mengetahui aktivitas antiproliferasi dari isolat herba tespong dengan konsentarsi yaitu nilai IC50 dari uji sitotoksik. FTIR digunakan untuk identifikasi isolat aktif herba tespong. Dari hasil penelitian didapat nilai IC50 isolat aktif herba tespong sebesar 38,079 µg/mL dan dikategorikan sebagai moderat aktif. Hasil doubling time menunjukkan isolat aktif herba tespong mampu memperlambat waktu proliferasi sel MCF7 selama 135,885 jam.