Tanaman Gambir (Uncaria gambir (Hunter) Robx.) mengandung senyawa metabolit sekunder seperti katekin, floursein, asam catechutannat dan quercetin yang dapat dimanfaatkan sebagai bahan pewarna alami, antioksidan, dan biopestisida. Tanaman gambir diperbanyak secara generatif melalui biji sehingga anakan yang dihasilkan memiliki tingkat variabilitas genetik yang tinggi. Teknologi kultur jaringan melalui kultur kalus mampu menyediakan kebutuhan bibit dalam jumlah yang banyak dengan sifat seragam dalam waktu singkat. Tujuan penelitian ini adalah mengetahui konsentrasi 2,4-D terbaik serta pengaruhnya terhadap proses pembentukan dan pertumbuhan kalus eksplan gambir. Desain penelitian menggunakan Rancangan Acak Lengkap dengan pemberian 2,4-D yang terdiri dari 5 taraf perlakuan yaitu 0; 0,5; 1; 1,5; dan 2 mg/L. Hasil penelitian menunjukan bahwa eksplan daun gambir mampu membentuk kalus pada seluruh konsentrasi 2,4-D yang diberikan. Terbentuknya kalus tercepat didapatkan pada pemberian konsentrasi 2,4-D 0,5 mg/L pada 17,86 HST dengan warna kalus putih kekuningan sebesar 56,7% dan bertekstur remah sebesar 76,7%.