Pasak Bumi (Eurycoma longifolia) secara etnofarmakologi digunakan sebagai obat herbal tradisional yang digunakan untuk afrodisiak dan vitalitas. Eurycomanon digunakan sebagai senyawa penanda dari ekstrak akar pasak bumi, namun kadar yang diperbolehkan dalam ekstrak pasak bumi sesuai standar Malaysia pada kisaran 0,8â1,5%, karena sifatnya yang toksik. Senyawa eurycomanon sebagai senyawa penanda dari pasak bumi masih jarang dan harganya cukup mahal. Oleh karena itu, sangat diperlukan isolasi eurycomanon dan validasi metode analisanya serta proses ekstraksinya. Proses isolasi diawali dengan ekstraksi metode maserasi menggunakan pelarut metanol terhadap akar pasak bumi yang sudah dibuat serbuk. Hasil ekstraksi dipekatkan dan difraksinasi dengan pelarut air dan metanol secara bertahap dari 0% - 100% metanol mengunakan kolom resin stiren-divinilbenzen. Fraksi target dicek menggunakan UPLC-MS dan dilakukan isolasi lebih lanjut dengan HPLC semi preparatif menggunakan kolom RP C-18. Hasil isolasi dicek kemurnian dan spectrum UV-nya dengan HPLC analitis dengan detektor PDA (photo diode array) dan dilakukan elusidasi stuktur dengan NMR. Hasil isolat yang terkonfirmasi sebagai eurycomanon dilakukan validasi metode analisa dan digunakan untuk menganalisa hasil optimasi awal proses ekstraksi. Fraksi target diperoleh dari fraksi 25% metanol dan disolasi lebih lanjut menggunakan HPLC semi preparatif. Isolat yang diperoleh telah dikonfirmasi dengan elusidasi stuktur NMR sebagai senyawa eurycomanon dari akar pasak bumi dengan kemurnian 96%. Metode analisa diperoleh dengan menggunakan HPLC secara gradien elusi (asetonitril:air) pada detektor UV 254 nm dengan kolom RP C-18, 150 x 46 mm, 5 µm. Kajian awal proses menunjukkan bahwa ekstraksi terbaik untuk akar pasak bumi dengan kadar etanol 30% pada suhu 50°C. Kajian ini dapat digunakan sebagai pembanding proses esktraksi akar pasak bumi yang berbeda dengan Buku Pedoman Teknologi Formulasi Sediaan berbasis Ekstrak dari BPOM tahun 2013 Volume 2, yaitu menggunakan sistem maserasi dengan pelarut etanol 96% dengan perbandingan 1:10.